최근 단백질-단백질간 상호 결합(Protein-Protein interaction, Peptide binding) 관련 하여 많은 이슈가 되고 있는 FP(Fluorescence Polarization) 연구에 대한 웹상 자료들 링크해 놓습니다.
FP(Synergy2)를 이용한 Protein-Protein, Peptide interaction 관련 인터넷 웹상 자료
Biophysical characterization of recombinant proteins: A key to higher structural genomics success
4. Protein–protein interaction and peptide binding/
4.2. Fluorescence polarization 항목의 중간 부분/
-The observed value of FP depends on free and bound fractions of labeled molecules. Instruments such as the Synergy 2 Microplate Reader (BioTek) or........
Structural Studies of the Tandem Tudor Domains of Fragile X Mental Retardation Related Proteins FXR1 and FXR2
Materials and Methods/
Fluorescence polarization screening of peptide substrates 항목의 중간 부분/
-The anisotropy of the sample was recorded with a Synergy 2 Multi-Mode microplate Reader (BioTek, Winooski, VT))......
Crystal Structure of TDRD3 and Methyl-Arginine Binding Characterization of TDRD3, SMN and SPF30
Materials and Methods/
Peptide binding Assays 항목의 중간 부분/
-The data were collected by the Synergy 2 (BioTec, USA) fluorescence polarization program and......
Identification of Lactoferricin B Intracellular Targets Using an Escherichia coli Proteome Chip
Materials and Methods/
Fluorescence polarization assays 마지막 부분/
The degree of polarization of each well was detected by a microplate reader, using an excitation wavelength of 540 nm and an emission wavelength of 590 nm with a dichroic mirror of 570 nm.........
Recognition and Specificity Determinants of the Human Cbx Chromodomains*
EXPERIMENTAL PROCEDURES/
Fluorescence Polarization 의 중간 부분/
Fluorescence polarization assays were performed in 384-well plates using a Synergy 2 microplate reader (BioTek).....
Recognition of Multivalent Histone States Associated with Heterochromatin by UHRF1 Protein*
EXPERIMENTAL PROCEDURES/
Histone Peptide SPOT Blot Peptide Array Screen and Fluorescence Polarization Binding Assays 의 중간부분./
For fluorescence polarization (FP) studies,.....FP assays were performed in 384-well plates using Synergy 2 microplate reader (BioTek).
Mapping the N-Terminal Residues of Epstein-Barr Virus gp42 That Bind gH/gL by Using Fluorescence Polarization and Cell-Based Fusion Assays
MATERIALS AND METHODS/
FP 항목의 중간 부분/
FP value was measured on the Synergy 4 plate reader (Biotek). The data were analyzed using Gen5 (Biotek) ....
Phosphodiesterases Catalyze Hydrolysis of cAMP-bound to Regulatory Subunit of Protein Kinase A and Mediate Signal Termination
EXPERIMENTAL PROCEDURES/
Fluorescence Polarization Assay for cAMP Dissociation 의 중간 부분/
A Biotek Synergy 4 Multi-Detection microplate reader (Winooski, VT) was used in FP mode for the plate reader assays.....
Structural and Histone Binding Ability Characterizations of Human PWWP Domains
Materials and Methods/
Fluorescence polarization assay 의 첫 부분/
Fluorescence polarization assays were performed in 384-well plates, using the Synergy 2 microplate reader from BioTek as described in.......
Crystal Structure of the Human SUV39H1 Chromodomain and Its Recognition of Histone H3K9me2/3
Materials and Methods/
Fluorescence Polarization 의 중간 부분/
The assay was performed in 384-well plates, using a Synergy 2 microplate reader (BioTek).
일반 형광실험 관련
Structural Biology of Human H3K9 Methyltransferases
Materials and Methods/
Histone Methyltransferase Assay 의 하단부분/
The methylation reaction was followed by monitoring the increase in fluorescence using Biotek Synergy2 plate reader with 360/40 nm excitation filter and 528/20 nm emission filter for 20 min in 384 well-plate format....
BioTek 홈페이지 Application Note
Optimizing Performance of the Transcreener® ADP Assay for the BioTek Synergy 2 and Synergy 4 Multi-Mode Microplate Readers
Automation of a Generic Fluorescent Methyltransferase Activity Assay
추천장비
SynergyNEO Synergy2
제품문의: 키싸이언스 김병기 차장 010 - 4340 - 9244
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BioTek 에서 2013년 08월 새롭게 출시된 Cytation3는
형광 현미경과 마이크로플레이트 리더기가 결합된 제품
이라고 생각하시면 되겠습니다.
1. 형광 이미지 관찰
- Automatic Digital Microscopy 장착.
- Auto focus, Auto exposure
- Automated image capture
- 주요 응용분야
(Cell counting, Cell proliferation, Cytotoxicity, Protein expression 등)
- 온도 컨트롤과 Gas controller(Co2, O2) 기능으로 Live cell 실험에도 적합
2. 마이크로플레이트 리더
- Absorbance (모노크로메이터 타입의 흡광측정)
- Fluorescence (모노크로메이터 또는 필터타입의 형광측정)
- Luminescence ( 모노크로메이터 또는 필터타입의 발광측정)
- TRF, FP, FRET 등과 같은 High end technology 분석.
자세한 장비의 검토는 아래 홈페이지를 참조하시면 됩니다.
주요 Application 자료들은 아래 페이지를 참조하시면 됩니다.
- Cell migration
- Cell counting & Transfection efficiency
- Cell Viability
- Inhibition Studies
Cell washing 과 Dispensing 을 한 장비에..
 Cell washing / 플레이트리더기자료 |
2013년 09월 BioTek 에서 새롭게 출시된 MultiFlo FX 시스템은 마이크로플레이트 워셔기와
분주기 가 한대의 장비에 결합되어 있어 세포배양 과정에서의 Media change 를 보다 수월하게
진행할 수 있도록 설계되어 있습니다. 특히 Cell 에 reagent 분주 시 damage 를 최소화 하기
위해 분주 바늘이 플레이트 웰의 벽에 분사가 되도록 설계되어 있습니다.
4종류의 서로다른 Reagent 를 장착할 수 있고 모듈화 되어 있어서 분주기능과 워싱기능중에서
원하시는 모듈을 선택할 수도 있습니다.
자세한 내용은 아래 홈페이지 참조 부탁드립니다.
구동 동영상
제품문의: 키싸이언스 김병기 차장 010 - 4340 - 9244
발광분석기법
Luciferase Assay / 플레이트리더기자료 |
◈ Introduction
Genetic reporting assay 는원핵세포 (Prokaryotic organism) 나 진핵세포 (Eukaryotic organism) 에서 외부자극 에의한 세포반응이나 유전자발현 연구를 위해 많이 사용하고 있는 실험기법입니다.
특히 Dual-reporter assay 는 실험의 정확도를 높이기 위하여 두 가지 독립적인 리포터시스템을 이용합니다.
그중 하나는 experimental reporter 로써 실험조건에 따라 반응정도가 달라지게됩니다.
다른 하나는 internal control 로써실험조건에 따라 변하지 않으며, experimental reporter 에 대한 값을 노멀라이즈 (normalize)하기 위해사용합니다.
Normalization 된 데이터는 transfection efficiency (유전자 삽입효율), cell viability, cell lysis, pipetting 과 같이 실험 과정 중에 발생할 수 있는 차이를 보정하여 사용할 수 있습니다.
Promega 의 Dual-GloTM Luciferase Assay System 은 두 가지 종류의반딧불이에서 분리한 firefly luciferase 와 Renilla luciferase 를 각각experimental 과 control reporter 로 이용합니다.
Firefly luciferase 는luciferin 를 기질로 사용하여 산화과정을 통하여 Oxyluciferin 으로 전환시키며, 560 nm 의 빛을 발산합니다. Renilla luciferase 는 coelenterazine 을 기질로 사용하여 산화과정을 촉매 시키며 480 nm 의 빛을 발산합니다. 이와 같이 두가지의 효소는 서로 다른 기질을 이용하여 다른 반응을 나타내므로, 하나의
시스템에서 동시에 사용이 가능합니다. (그림 1)
그림 1. Bioluminescent Reactions Catalyzed by Firefly and Renilla Luciferase
실험 방법은 다음과 같습니다.
Dual-GloTM Luciferase Assay System
1. Firefly luciferase 에 대한 기질을 넣고 반응시킨 후, firefly luciferase 에대한 활성 (발광) 측정
2. Stop & Glo 시약을 넣고, 반응
3. Renilla luciferase 에 대한 활성 (발광) 측정
4. Normalization: 각 well 에 대한 Firefly : Renilla ratio 를 계산
이번 Application note 에서는 Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader 를 이용한
Dual-Glo luciferase 의 활성 측정 방법을 소개합니다.
◈ Result and Discussion
그림 2 은 각각의 단백질 (luciferase) 활성을 측정하기 위하여 농도를 다르게 하여 측정한 실험 결과 입니다.
두 가지 단백질 모두 농도가 증가함에 따라 발광값 (Luminescence)도 함께 증가합니다.
그림 2. Firefly luciferase and Renilla Luciferase Concentrations curves
Firefly 와 Renilla luciferase 의 활성이 독립적으로 일어나는 반응을 확인하기 위하여, Renilla luciferase 의 농도는 유지하고, Firefly luciferase 의 농도만 계단 희석 했을 때의 결과입니다.
Firefly 의 농도와는 상관 없이 Renilla luciferase 의 발광값은 모두 일정하게 유지되는 것을 확인할 수 있습니다
(그림3).
두 가지 단백질의 활성이 다른 것에 영향을 주지 않으므로, firefly 는 실험 조건에 따른 결과를 볼 때 이용하며, Renilla 는 internal control 로 이용할 수 있습니다.
그림 3. Firefly and Renilla singals from Common wells
그림 4 은 그림 3 의 결과를 비율로 표시한 것입니다.
X 축은 Firefly luciferase 와 Renilla luciferase 의 Molar ratio (Firefly/Renilla)에 따른 결과입니다.
Y 축은 Firefly luciferase 와 Renilla luciferase 의 signal ratio(Firefly/Renilla)의 결과입니다.
동일한 well 에 Firefly 가 없고, 많은 양의 Renilla 가 존재할 경우, 매우 낮은 값의 molar ratio 로 계산됩니다.
반대로, 높은 값의 molar ratio 는 firefly 의 양이 많고, Renilla 의 양이 거의 없을 때를 계산되며, Molar Ratio 는 Signal Ratio 와 비례하여 다음과 같은 그래프로 나타낼 수 있습니다. (그림 3)
그림 4. Comparison of the Firefly/Renilla Signal Ration to Firefly/Renilla Enzyme molar ratio
Firefly 와 Renilla 발광 시그널 (luminescence signal)은 안정적이고 오랫동안 지속이 되므로 Dual-Glo assay
기법을 이용하여 다양한 유전자 리포터 샘플을측정할 수 있습니다.
추천장비
SynergyHT Synergy2
제품문의: 키싸이언스 김병기 차장 010 - 4340 - 9244
Autmation of HTRF elFE Kinase Assay
3D cell culture / 플레이트리더기자료 |
◈ Introduction
신약을 개발하는 단계 중, 약의 효력을 확인하기 위해서는 cell-based, functional assay 등 생물학적으로
연관된 수많은 실험을 진행하게 됩니다.
하지만 기존에 주로 사용되었던 2 차원으로 배양한 세포 반응은 3 차원으로 구성된 실제 생물체 내에서의
반응과 차이가 크게 나타납니다. 우리 몸을 구성하는 세포 외 기질(Extracellular matrix, ECM)은 대부분
collagen(콜라젠)으로 구성되어 있으며, 세포와 세포의 상호작용 (세포 성장,이동, 사멸 등)이 일어나는 중요한
공간입니다.
2 차원으로 배양된 세포에서는 이러한 환경이 제공되기 어렵기 때문에 3 차원 세포배양 시스템을 통해서 실제
생물체의 반응을 보다 정확하게 재현할 수 있습니다.
RAFTTM (Real Architecture for 3D Tissue, TAP Biosystems) 는 세포와 collagen hydrogel mix 를 이용한 3 차원
세포배양 시스템입니다. 그 과정은 다음과 같습니다.
◈ RAFT 3D Cell Culture System
A. 준비한 세포와 collagen mix 를 잘 섞어서 96-well plate 에 분주
B. 멸균처리가 된 96-well RAFT plate 흡수재(Absorbers)
C. 96-well RAFT plate 흡수재를 세포와 collagen mix 가 분주 된 plate 에 넣는다.
D. 96-well 안의 배지 (medium)는 흡수재를 통하여 흡수되고, collagen 과 세포가
뭉쳐지면서 in-vivo (생채 내 환경)이 된다.
E. 배지가 모두 흡수되어, 120 μm 두께의 hydrogel 상태가 된다.
F. 흡수재를 제거하고, 새로운 배지를 넣는다.
3 차원 배양시스템을 만드는 과정에서 Cell/Collagen mix, 배지, 시약 분주와 같은 단계는
MultiFloFX Microplate Dispense 를 이용하여 실시할 수있으며,
Cytation3 Cell Imaging Multi-Mode Reader 를 이용하여 배양된 세포의 이미지 캡쳐와 elF4E 단백질이
인산화 된 정도 (filter-based system 을 사용한 HTRF 방법) 를 함께 측정할 수 있습니다.
Cytation3 Cell imager:
MultiFlo FX automated Dispenser & Washer
◈ RAFT 3D Cell Culture System
A. Inhibition step: Microplate 에 배양된 세포에 Inhibitor (약물) 처리
B. Lysis step: 약물처리한 세포를 용해시켜, 세포 내에 존재하는
elF4E 단백질을 밖으로 내보냄
C. Detection step: 용해한 세포에 형광 물질이 표지 된 항체를 넣고,
elF4E 단백질과 반응 정도를 확인
◈ Result and Discussion
분주 및 워싱 단계에서 MultiFloFX (자동 분주, 워싱시스템)를 이용한 방식과 메뉴얼 (직접 분주, 워싱) 방식으로
했을 때의 결과 비교입니다. Z’value 는positive control 과 negative control 을 여러 번 반복 실험하였을 때,
데이터의 균일한 정도를 나타내는 지표이며, 1 에 가까울수록 좋은 실험 결과를 의미합니다.
A.는 MultiFloFX, B.는 EL406, C.는 메뉴얼 방식으로 실험했을 때의 결과이며,
자동화 시스템을 이용했을 때, 데이터의 균일도가 더욱 높음을 확인할 수 있습니다.
Automated Assay Robustness Assessment
Cytation3 Imaging of 3D Tumoroid Structures
Cytation3 를 이용하여 3 차원으로 배양된 암세포, 즉 Tumoroid 를 초점을 달리하여 여러 장 측정한 후, CombineZP 소프트웨어를 이용하여 하나의 이미지로 합친 결과입니다.
MultiFloFX 를 이용하면 여러 단계의 과정을 한 장비 안에서 수행할 수 있고, 배지와 시약의 정확한 분주가
가능합니다.
또한 RAFT 3D Cell culture system 을 이용한 HTRF elF4E assay 결과는 3 차원적인 이미지와 함께 비교
분석될 수 있습니다.
문의: 키싸이언스 김병기 차장 010 - 4340 - 9244/ 042-828-6210
OrisTM Pro Cell Migration Assay(세포이동분석)
Cell migration / 플레이트리더기자료 |
Investigation of Cell Migration using a High Density Cell
Exclusion Assay and Automated Microplate Imager
Cell migration 는 생물학적 또는 환경적인 신호에 의하여 세포가 이동하는 것을 의미합니다.
일반적으로 이러한 현상은 개체의 발달, 면역 반응, 상처 치료 또는 암 전이, 심혈관계 질환,
관절염과 같은 질병에서 발생하게 됩니다.
이번 Application Note 에서는 Microplate 에서의 cell migration 을 확인하기 위하여,
OrisTM Pro Cell Migration Assay 키트를 사용하였으며 방법은 다음과 같습니다.
OrisTM Pro Cell Migration Assay (그림 1)
1. Biocompatible gel (BCG)를 96- 또는 384-well 가운데에 넣는다
2. 각 well 에 세포를 넣고 배양한다.
3. 세포는 BCG 를 제외한 나머지 부분에 부착되고, BCG 는 배지 안에서 녹아
없어진다.
4. BCG 에 의하여 Detection zone 이 형성되면, cell migration 에 이용할
compound (inhibitors or activators)을 처리한 후, 해당 부분에 모여든 세포의
결과를 분석한다.
그림 1. Oris Pro Cell Migarion Assay
Cytation3 Cell Imaging Multi-Mode Reader (including CO2/O2 Gas controlle)를 이용하여
장비 안에서 well 내부의 세포 변화를 실시간으로 측정합니다.
측정한 이미지를 이용하여 detection zone 의 닫힌 정도(Closure)를 확인하며, 해당 부분에
존재하는 세포의 형광 intensity 를 리더 모듈에서 측정할 수 있습니다.
◈ Results and Discussion
Optimization of Cell Seeding Density: Oris™ Pro 96-well Assay
본 실험에 이용할 세포의 적정 농도와 배양 시간을 최적화시키기 위한 예비 실험,
배양 시간에 따른 변화는 이미지로 측정하여 확인할 수 있습니다 (그림 2).
그림 2. Seeding density and incubation time optimization
Cytochalasin D (CD)는 cell migration 을 억제하는 물질입니다. 서로 다른 농도의 Cytochalasin D 를
세포에 처리하여, 세포 이동이 효과적으로 억제되는 농도를 확인한 결과입니다 (그림 3).
측정 결과는 Gen5 소프트웨어를 이용하여 Detection zone 의 표준편차 (Standard deviation)를 계산합니다.
또는 Gen5 소프트웨어에서 캡쳐한 tiff. 파일의 이미지는 Image J 라는 분석소프트웨어를이용하여
면적 (Area, μm2)을 확인하고, % Closure 로 계산할 수 있습니다.
(Image J 소프트웨어는 http://rsbweb.nih.gov/ij/에서 무료로 다운받을 수있습니다.)
그림 3. Image J analysis of CD dose response
측정한 결과를 토대로 그래프를 이용하여 데이터 분석이 가능합니다 (그림 4).
그림 4. Dose response curves
추천 분석장비
Cytation3
High contents Microplate cell imager
문의: 키싸이언스 김병기 차장 010- 4340 - 9244/ 042-828-6210
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1. Introduction
세포의 증식이나 활성, 세포 독성 평가는 생물학 실험에 필수적인 기법 중 하나이며,
일반적으로 다음과 같은 실험에 적용할 수 있습니다.
약물에 따른 세포 독성 평가
Growth factor 에 의한 활성 분석
환경 독성 물질 스크리닝
항암제의 잠재적인 세포 활성 억제에 대한 평가
세포의 생존율과 증식에 대한 연구 기법은 현미경을 이용한 분석, 셀 카운팅,
분광학적인 방법 등 여러 종류가 있습니다. 이 중 분광학적인 방법은 살아있는
세포의 양(수)을 간편하고 안전하게 대량으로 측정할 수 있어 현재 많이 사용하고
있습니다. 이를 위해서 Tetrazolium salts 중에 하나인 MTT 시약을 가장 보편적으로
사용하며, MTT 변형 물질에는 XTT, MTS, WST 등이 있습니다. 각 물질의 종류에
따라 다른 파장으로 흡광도를 측정하게 됩니다.
2. Principle of MTT assay
어떤 화합물이 세포에 어느 정도의 독성을 나타내는지 확인하는 실험, 정확하게는
미토콘드리아의 활성을 측정하는 실험입니다
살아있는 세포에 MTT(노란색, 수용성)를 처리하게 되면, MTT 가 미토콘드리아에
있는 reductase 에 의해 환원되어 formazan(보라색)이라 불리는 crystal 을 형성하게
됩니다. 죽은 세포에서는 미토콘드리아가 이미 깨져 없기 때문에 formazan 이
형성되지 않습니다
비수용성인 formazan 을 유기용매로 녹여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하며,
측정된 OD 값은 살아있는 세포와 비례합니다.
3. Method
1) 적정 농도의 세포 부유액을 Microplate 에 넣고, 37°C, 5% CO2 에서 배양한다.
2) 테스트하고자 하는 물질 (Serial Dilution) 처리 후, Incubation
3) 세포 배양액을 제거하고 새로운 배양액 100ul 와 MTT 시약 10ul 를 넣고,
37°C 에서 4 시간 배양한다.
4) Media 를 제거하고 100ul 의 SDS-HCl (또는 DMSO)를 넣고 파이펫팅한다.
(버블이 많이 생기므로 조심스럽게 Mixing)
5) Microplate Spectrophotometer 에서 570 nm 파장으로 흡광도를 측정한다.
(셀 측정을 위한 Area-Scan 모드 추천)
추천 분석장비
Epoch EON ELX808
문의: 키싸이언스 김병기 차장 010 - 4340 -9244
플레이트 세척기(washer)
Plate Washer / 플레이트리더기자료 |
Overview of Microplate Washer
◈ Purpose of use !
Microplate washer는 주로 마이크로플레이트 내부에서 반응하지 않은 물질 (redundant)을 제거하기 위하여 사용 합니다.
이것은 실험 중간과정에서 이루어 지며, 마이크로플레이트 내부에 존재하는 기존의 버퍼를 제거하는 과정 (Aspiration)과
새로운 버퍼를 분주하는 과정(Dispense)이 반복됩니다.
이러한 과정은 매우 단순하지만 반복적인 작업이기 때문에 지루하고, 파이펫팅 과정에서 피곤함을 느끼며 많은 시간이
소요됩니다. 또한 Manual 방식의 경우 여러 가지 실험적 인 오류를 범할 수 있습니다.
◈ Microplate washer 사용시, 장점
1. No Carryover (No Cross contamination)
•반응하지 않은 물질의 제거 과정에서 버퍼가 다른 well 내부로 넘어가서 샘플끼리 섞이는 경우를 방지
•마이크로플레이트의 모든 well (또는 지정한 부분)을 헷갈리지 않고, 정확하게 세척 가능
2. Reliability, High repeatability, Low coefficients of variations
•동량의 버퍼가 분주가 분주되고, 같은 높이에서 aspiration 되므로 모든 well이 동일하게 세척됨
•모든 well이 같은 조건의 프로세싱으로 진행되므로, 높은 재현성과 믿을 수 있는 결과 제공
3. Save time, Safety
•세척 회수, 볼륨 등 셋팅된 조건에서 자체적으로 진행되므로, 세척이 되는 동안 다른 일을 수행할 수 있음
•실험 양이 많을 경우, BioStack을 연결하여, 대량의 마이크로플레이트 처리 가능
•몸에 해로운 버퍼와 시약을 장비에서 다룰 수 있으므로 취급에 안전함
•erosol cover 사용으로 몸에 해로운 버퍼가 밖으로 튀는 것을 방지
◈ Features
BioTek의 Micoplate Washer는 ELx50, 405 Touch,405 LS, ELx405 Select Deep well 모델이 있으며,
마이크로플레이트 타입, 실험 목적 (ELISA, Cell washing,Separation 등), 장비 기능, 처리양 등에 따라
다양한 옵션을 추가할 수 있습니다.
BioTek의 Micoplate Washer는 다음과 같은 특징을 가지고 있습니다.
1.다양한 Flow rate (분주 속도) 조절
2.실험에 따라 Dispense, Aspiration 높이 및 X, Y축 조절 (모델에 따라)
3.Aspiration 시, Travel rate 조절 (Manifold가 내려가는 속도 조절 가능)
4.Buffer selection 기능으로 최대 세(3)가지 (ELx50) 또는 네(4)가지 (405 Series) 버퍼 사용 가능
5.Waste & vacuum sensing, fluid & flow detection기능
6.Ultrasonic cleaning 기능: 막혀있는 manifold를 강한 음파로 뚫어 줌
7.Verify Technology 기능: 막혀있는 manifold 부분 확인
8.Dual ActionTM Manifold 사용 시, dispense와 aspiration manifold는 따로 조절
9.Magnet bead assay, Vacuum filtration 가능
10.25 μl ~ 3000 ml 사이의 분주 범위, 1 μl 간격으로 조절 가능
11.실험에 따라 Shaking, Soak time 조절 !◈ Application
Micoplate washer는 다음과 같은 실험에 이용할 수 있습니다.
1. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay)
•실험 중간 과정에서 항원-항체 반응이 일어나지 않은 물질들을 제거
2. Cell-based assays (cellular assays)
•Cell-based assay를 위한 세포 배양 시, 배지(medium) 교체 또는 버퍼를 이용한 Cell washing
•Travel rate, Flow rate, 높이 조절 등을 통하여 세포가 well 내부에서 떨어지지 않도록 조절 가능 (데미지 최소화)
3. Biomagnetic and polystyrene bead processing (Luminex xMap Technology)
•사용하는 bead 타입에 따라 장비를 이용한 separation assay 가능
•Polystyrene bead는 Filtration 방법 이용
•Magnetic bead Magnet을 이용하여 Bead와 결합하지 않은 물질들을 효과적으로 제거
4. Filtration-to waste processes
•Example: DNA sequencing reaction clean-up
•해당 물질 이외의 다른 버퍼를 제거하기 위하여 다양한 크기의 filter를 이용
•샘플의 점도에 따라 vacuum 조절 가능
제품문의: 키싸이언스 김병기 차장 010-4340-9244
ROS (Reactive Oxygen Species),활성산소를 이용 세포 변화 관찰
활성산소(ROS)측정 / 플레이트리더기자료 |
Using BioTek’s SynergyTM HT Reader to Measure Reactive Oxygen Species
(ROS) Generation in Stimulated Cells
◈ Introduction
세포와 관련된 연구를 하는 사람들에게 세포의 성장을 억제하거나 자극하는 생물학적 제제를 개발하는 것은
매우 흥미로운 일입니다.
대표적인 예로 ROS (Reactive Oxygen Species), 즉 활성산소를 이용하여 세포에 대한 변화를 관찰하는 것이
있습니다.
ROS는 세포 신호 전달, 유도, 세포 사멸, 유전자 발현 등 세포 내에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져
있습니다.
ROS를 이용하는 다양한 실험 방법이 있지만, 그 중에서도 fluorescent probe을 이용하여 측정하는 방법이 많이
사용됩니다.
이번에는 세포 성장 자극에 의한 ROS 생성 결과를 DCF 형광 물질을 이용하여 SynergyTM HT로 측정하고 분석
하는 방법을 소개합니다.
다양한 효소 중에서도 NADPH oxidase는 ROS 일부분을 인지하고 다양한 단백질들을 모아 세포 내로 신호를
전달하는 역할을 합니다. (그림 1)
Figure 1. schematic illustration of the activation of NADPH oxidase
◈ DCF reactions
ROS의 형성을 확인하기 위하여 DCF라는 형광을 측정합니다. DCF는 세포막을 투과하여 ROS와 만나면 강한
형광을 띄게 됩니다.
세포 내 자극이 주어진 상태에서 ROS 생성이 계속되면, 형광 시그널 또한 계속 이어지게 됩니다.
반면, ROS 형성이 없을 경우 형광은 측정되지 않습니다. (그림 2)
Figure 2. Formation of fluorescent Compound DCF by ROS.
◈ Results
그림 3은 SynergyHT를 이용하여 세포 자극 정도에 의한 DCF 형광을 측정한 결과입니다.
세포 자극을 주기 위하여 PMA, Serum (혈청)을 이용하였고, 양성 대조군으로 특별한 세포 자극 없이 ROS를
형성할 수 있는 Glutathion oxidase라는 효소를 이용하였습니다.
이러한 물질들에 의하여 자극을 받은 세포는 ROS를 형성하고, 이어서 DCF 형광을 발산하게 됩니다.
반면, 자극이 없는 세포는 형광 값에 대한 변화가 없습니다.
Figure 3. DCF Fluorescence in Stimulated Cells Measured over Time.
Cells were treated with 1 mU/mL of Glutathione oxidase (magenta); 10 μM PMA (green); 0.25% FBS serum (red); or untreated (blue).
그림 4는 세포 자극을 주고 30분 후, 형광 측정값을 비교한 결과입니다. 세포 자극이 전혀 없었던 0% FBS는
거의 형광 측정값이 확인되지 않습니다. 그러나 0.25%는 3배 그리고 1 μM PMA는 5배 높은 형광값이 측정된
것을 확인할 수 있습니다.
Figure 4. PMA & serum induction of H2O2 as measured by endpoint fluorescence after 30 min.
◈ Discussion
BioTek의 Synergy multi-reader는 외부 자극에 의한 세포 내 ROS형성을 측정할 수 있는 장비입니다.
전용 opitc과 deep blocking bandpass filter 및 PMT를 사용하여 고감도 측정이 가능합니다.
또한 Gen5 소프트웨어를 사용하여 각 포인트 별 데이터의 변화를 확인할 수 있고 그래프를 형성하여 정확한
데이터 분석이 가능합니다
관련장비
제품문의: 키싸이언스 김병기 차장 010-4340-9244/ 042-828-6210
약물의 막투과성(permeability)평가
PAMPA assay / 플레이트리더기자료 |
약물의 생체내이용률을 좌우하는 인자는 매우 다양하다.
따라서 각 요인들의 기여도를 따져보며 진단할 필요가 있으나 개발의 초기단계에서 모든 파라미터를 구하기에는 다소무리가 따른다. 이런 이유로 인해 초기단계에서는 빠른 의사결정을 위해 후보물질의 permeability와 metabolism 위주로 진단을하게 된다.
약물의 permeability를 평가하는방법으로는 PAMPA assay와같은인공지질막을이용하거나 Caco-2 세포같은
살아있는세포를 이용하는 방법이 주로 사용된다. PAMPA assay는 단순히 지질막을 이용하므로 단순확산
과정만을통한 permeability를측정하는 assay이다. 이와는달리 Caco-2 세포는몇가지 efflux 수송체 (예: P-gp)를 발현하고 있으므로 efflux 수송체에 의한 permeability도 평가할 수 있다.
두assay에서 측정되는 permeability 값이 대략 100 nm/sec 이상일 경우 permeability가 높은 것으로평가할수
있다. 실제로두 assay에서평가된 permeability와사람에서의흡수율(%) 사이의상관성을 비교해 보면 permeability가 100 nm/sec 이상일 때 흡수율이 85% 이상인 것으로 나타났다
그렇지만 100 nm/sec 이하일 경우에는 permeability 값과 흡수율(%)이 대체로 비례관계가 성립하는 것으로 보인다. 따라서, PAMPA와 Caco-2 assay에서 나오는 permeability 값이 100nm/sec 이상이면 사람에서 높은 흡수율을 예상할 수 있지만 그 이하일 경우엔 불완전한 흡수를 보일것으로 평가하면 된다.
◈ Introduction
경구로 투여된 약물은 소장에서 흡수 과정을 거쳐 전신을 순환하다 목표로 하는 장기에 도달하여 약효를 발휘하게 됩니다.
신약 개발 초기 단계에서는 많은 수의 후보 약물들이 만들어지는데, 이것들이 in vitro에서 아무리 효과가 좋을지라도 우리 몸에 투여되었을 때 혈중농도가 기대에 미치지 않거나 생체 내 이용률이 충분히 높지 못하면 신약으로서의 가치를 잃게 됩니다.
약물의 생체 내 이용률을 확인하는 가장 빠른 방법은 permeability (투과도)와 solubility (용해도)를 확인하는
방법입니다.
invitro 활성 시험에서 화합물이 세포 내 표적에 도달하기 위해서는 세포의 지질 이중층막을 투과해야 합니다. (그림 1).
그림 1. 투과도와 용해도의 상관관계
약물의 생체 내 이용률을 확인하기 위하여 동물 실험, 인체 실험을 하기까지는 많은 시간과 돈이 들어갑니다. 따라서 최근에는 PMAPA (parallel artificial membrane permeability) assay와 같은 인공지질막을 이용하는 방법이 주로 사용됩니다.
pION 사의 Double-Sink 방법은 in vivo 상의 조건과 유사한 상태로 물질 이동을 측정할 수 있는 장점이
있습니다
(그림 2).
그림 2. PAMPA Explorer Sandiwitch plate의 단면; 지질막 (Filter lipid)를 사이에 두고,
샘플을 넣는 Donor와 투과되어 나오는 Accptor로 구성
이러한 방법은 pION의 PAMPA ExplorerTM kits의 전용 장비와 Metoprolol 소프트웨어를 이용할 수도 있
으나, Biotek사의 Epoch Monochromator-based microplate reader를 이용할 수 있으므로 저비용으로
약물 투과도를 측정할 수 있습니다.
PAMPA Measurement with Epoch
Microplate Spectrophotometer
* 200 – 500 nm spectral scanning
* UV transparent microplates 필요
◈ Results & Discussion
측정 OD 값이 낮게 나온다면, 약물의 투과도 자체가 높지 않거나, 백그라운드 (background) 영향 때문일 수
있습니다.
실험 시 background 값은 10-3 OD(=0.001) 보다 낮은 값으로 나와야 합니다.
그림3은 Epoch를 이용하여 200 – 500 nm 스캐닝 시,background를 테스트한 결과입니다.
그림 3. Epoch를 이용한 200 – 500 nm scanning 결과
평균 noise level은 0.0003 OD 이며 최고 0.0005를 넘지 않습니다. 따라서 Pampa assay 시, 저렴한
모노크미터 타입의 Epoch를 이용하여 낮은 background로 정확한 약물 투과도를 측정할 수 있습
니다.
관련장비 Epoch Microplate Spectrophotometer
제품관련 문의: 키싸이언스 김병기 차장 010-4340-9244
SWORD ELISA 키트이용 Resonance Raman Signal Based Peroxidase Detection
IL-6 Cytokine / 플레이트리더기자료 |
◈ Introduction
효소면역반응 실험 (ELISA assay)는 오랜 시간 동안 바이오-메디칼 연구를 하는데 이용되고 있는 실험법입니다.
이 실험 방법은 색을 띄는 기질(substrate)을 이용하여 분석하고자 하는 단백질을 검출하거나 그 양을 측정
할 수 있습니다.
매우 낮은 농도의 단백질을 검출해 내기 위해서는 좋은 항체 또는 기질을 사용하거나 민감도 (sensitivity)가 높은 장비를 사용해야 합니다.
Synergy H4 Hybrid microplate reader를 이용하여 라만 시그널을 방출하는
Sword Reagent peroxidase substrate를 이용하여 IL-6 단백질 검출하는 방법을 소개하겠습니다.
Principle of the ELISA Assay
이 실험에서 사용하는 ELISA 방법은 정량적 샌드위치 효소면역반응 실험법입니다.
1.마이크로플레이트에 IL-6와 결합하는 정제된 항체를 코팅한다.
2.스탠다드와 샘플을 플레이트에 넣고 반응시킨다.
3.결합하지 않은 물질을 제거한다. (세척)
4.효소가 표지된 항체를 추가하고 반응시킨다.
5.다시 결합하지 않은 물질을 제거한다. (세척)
6.기질을 넣고 반응하여 형광을 측정한다.
Sword Diagnostics Reagents 사용하는 검출 시약은 페록시다아제 기질 (peroxidase substrate)이며,
이것은 라만 작용을 합니다.
참고로 라만 작용은 일반 형광의 Emission과는 달리, 기질에 빛을 쪼여줄 때, 다른 색깔의 빛이 산란되어 나오는 것을 의미합니다.
이 방법은 TMB라는 기질을 이용하여 450nm의 흡광도에서 측정하는 ELISA 방법에 비하여 민감 도가 매우
높으며, 상대적으로 낮은 농도의 단백질도 검출할 수 있습니다. (그림 1)
그림 1. Sword Technology
◈ Results
이 실험에서는 SynergyH4를 이용하여 excitation 530 nm, emission 700 nm에서 측정하였습니다.
그림 2. Spectra of Resonance Sword Reagent Raman Emission
해당 파장을 이용하여 모노크로메이터 방식과 필터 방식을 이용하여 각각 측정하고 측정 높이 (z-height)와
PMT gain에 따른 측정 결과는 다음과 같습니다.
1.Z축 측정 높이 조절 (그림 3)
Filter: 4 ~ 11 mm 사이로 측정한 결과 7 mm에서 가장 높은 시그널 측정
Monochromator: 4 ~ 12 mm 사이로 측정한 결과, 높이가 올라감에 따라 시그널 증가
그림 3. Optimization of Top probe Zheight with Mono and Filter Optical Paths
그림 4. Optimization of PMT Gain for Mono and Filter Optical Paths
두 가지 측정 방법 모두 Gain 값이 올라감에 따라 측정값 증가
Limit of detection (LOD)
라만의 필터와 모노 측정 방식, 그리고 흡광도를 측정하여 IL-6의 검출 농도를 확인한 결과입니다.
필터와 모노 방식의 측정 결과에서는 비슷한 6.3과 6.4의 비슷한 최저 검출 농도가 확인되었습니다.
그러나 흡광방법을 이용 하였을 경우, 민감도의 차이로 인하여 상대적으로 높은 최저 검출 농도를 보이고 있으며, 측정 그래프도 오른쪽 으로 약간 밀려있습니다. 뿐만 아니라 EC50 농도도 흡광 방법을 이용한 방법에서 약 3배 정도 높은 수치입니다. (그림 5)
그림 5. Comparison of Sword Peroxidase reagents and TMB IL-6 Dosee response curves
◈ Discussion
SynergyH4 Multi-Mode Microplate Reader를 이용하여 Sword peroxidase 시약으로 IL-6 측정시,
일반 흡광도 측정에 비하여 약 3-4배 정도의 낮은 농 도까지 검출할 수 있습니다.
SynergyH4는 실험에 따라 모듈을 구성할 수 있으며, 앞에서 언급한 실험처럼 Raman emission을 측정하기
위해서 모노 또는 필터 방식, PMT 구성 (standard low-noise PMT 또는 extended red PMT) 등을 할수 있습니다. 또한 tungsten halogen lamp 또는 xenon flash lamp를 선택하여 이용할 수 있습니다.
평균 noise level은 0.0003 OD 이며 최고 0.0005 를 넘지 않습니다.
제품관련 문의: 키싸이언스 김병기 차장 010-4340-9244
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